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          RNA提取原理

          發布時間: 2020-05-11   

           

          RNA提取原理
          提取時,加lv仿后分三層:水相(含rna,可能還有少量DNA),中間白色薄層(應該是蛋白和DNA),下層有機相(lv仿和蛋白等)
          lv仿是分子量比較大的有機溶劑,在提取RNA時,lv仿可以有效的使有機相和無機相迅速分離。DNA提取過程 有機相中主要是酚和蛋白結合,從而使得蛋白和DNA脫離,DNA進入水相。但是在RNA的提取過程就要避免蛋白和DNA脫離,否則DNA會釋放到水相。不管有酚也好,沒有酚也好,lv仿本身也對蛋白有變性作用,劇烈的震蕩,很容易使得DNA的親水基團,與水相接觸。所以不要劇烈震蕩。

          yi丙醇的作用是通過-OH的疏水作用使得RNA 或者鏈中的親水基團受到保護,等同于沉淀,但是這是個反應時發生在水相中,與前面的lv仿不矛盾。
          lv仿的作用有多個方面,一是作為有機溶劑變性蛋白,使其沉淀并通過離心除去,同時也通過變性作用抑制RNase活性;二是RNA提取試劑中通常含有ben酚Trizol主要成分就是ben酚,很多自己配試劑提的方法也用ben酚,抽提蛋白時也會用到ben酚),ben酚微溶于水,抽提烷之后水相里有痕量的酚,如果不除去會損傷核酸,需要通過lv仿把水相里參與的ben酚抽提掉;三是作為溶劑抽提樣品中的一些脂溶性雜質(比如油脂、脂溶性色素等),起到一定除雜作用。
          因為細胞中存在DNA酶,在提取之前細胞破碎的時候沒有加DNA酶抑制劑,DNA已經被分解了。上層水相,PH 5.1左右,當溶液pH在酸性的時候,DNA分子就會沉淀在酚與溶液的界面,只有RNA分子留在水相。而當pH接近中性時,DNA就會溶解在水相,(導致PH中性的大概原因是trizol與樣品比例不對,應該盡量保證提取量的前提下使trizol過量)
          TRIzol Reagent 提取total RNA步驟:
          1. 查下表根據樣品量選擇適當的 TRIzol Reagent體積裝入50ml RNase-free離心管中,注意樣品體積不能超過TRIzol Reagent體積的10%。

          組織量

          TRIzol Reagent

          lv仿

          yi丙醇

          75%乙醇

          50~100mg

          1ml

          0.2ml

          1ml

          1ml

          2.將組織樣品放入TRIzol Reagent中,高速下勻漿15-30秒/次,直至看不見組織和細胞碎片。
          3.室溫溫育10分鐘。
          4. 據表2加入適量體積的lv仿,劇烈震蕩15秒鐘,然后室溫下溫育3分鐘。
          5. 4oC,12000g離心15分鐘,形成淡紅色的ben酚/lv仿有機相,中間相和上層水相,水相約占TRIzol體積的60%。
          6. 轉移上清于另一個Rnase-free的 50ml離心管中。根據表2加入適量yi丙醇,-20oC沉淀1小時以上。
          7. 4oC,12000g離心10分鐘。
          8. 去上清,據表2加入適量體積的75%的乙醇混勻。
          9. 4oC,7500g離心5分鐘。
          10.去上清,空氣中干燥或真空抽干RNA沉淀,但不要太干。加入適量體積的DEPC-WATER,溶解沉淀。
          11.取少量RNA用于測定其OD值和電泳,其余置-80oC冰箱中保存,


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